超快组装软件的使用--hifiasm软件
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背景
三代组装常用的软件有canu、Falon、WGTBG及SmartDenovo等。canu软件的优点是组装的准确度高、连续度表现优秀的概率高，缺点是速度比较慢；而WTDBG软件运行速度快、但是对重复序列比较敏感，对简单基因组组装效果较好，Falon比较合适一定的杂合基因组组装。而最近发布出来的hifiasm，可以在一周内完成超大基因组的组装，极大的降低了整体的分析时间。
加州红杉的相关数据如下：
服务器配置：64核 512Gb RAM
生成HiFi数据：46,000 CUP hours
基因组组装：7,200 CUP hours， 总共分析时间6天
为了进一步的了解这个软件的使用，我们下载了相关ccs的数据进行组装的测试。
01
软件原理
Hifiasm使用的是Pacbio的Hifi序列，基于单倍性的快速组装工具。不同于目前大多数软件，hifiasm在组装中尽可能的保留了多的单体型信息。
对于非trio家系的组装，输入的是hifi的序列（fastq或者fasta格式），而对于trio家系的组装，除了需要hifi序列外，还需要父亲、母亲的index文件（可以使用yak来生成）。
02
软件安装
1# Install hifiasm (requiring g++ and zlib)
2git clone https://github.com/chhylp123/hifiasm
3cd hifiasm && make
4# Assembly
5./hifiasm -o NA12878.asm -t 32 NA12878.fq.gz
03
测试数据下载
从GIAB上下载pacbio的数据。GIAB是一个标准品的数据，里面包含了各种测序平台的数据，正好可以拿来作为测试数据。
路径为： ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/ReferenceSamples/giab/data/NA12878/PacBio_SequelII_CCS_11kb/
由于下载下来的是bam格式，需要转换成fasta格式。
samtools view *.bam | awk '{print ">"$1"\n"$10}' > fasta
04
软件参数说明
1 ./hifiasm
2Usage: hifiasm [options] <in_1.fq> <in_2.fq> <...>
3Options:
4 -o FILE prefix of output files [hifiasm.asm]
5 -t INT number of threads [1]
6 -r INT round of correction [2]
7 -a INT round of assembly cleaning [4]
8 -k INT k-mer length [40] (must be < 64)
9 -i ignore saved overlaps in *.ovlp* files
10 -z INT length of adapters that should be removed [0]
11 -m INT size of popped large bubbles for contig graph [10000000]
12 -p INT size of popped small bubbles for haplotype-resolved unitig graph [100000]
13 -n INT small removed unitig threshold [3]
14 -x FLOAT max overlap drop ratio [0.8]
15 -y FLOAT min overlap drop ratio [0.2]
16 -v show version number
17 -h show help information
18Example: ./hifiasm -o NA12878.asm -t 32 NA12878.fq.gz
19See `man ./hifiasm.1' for detailed description of these command-line options.
其中常用的为：
-o ：输出文件的前缀
-t：线程数
-k：kmer数
-z ：adapter的长度
05
软件使用
hifiasm -t 32 -o hifi fasta
-t 线程数目
-o 结果前缀
06
结果说明
prefix.r_utg.gfa （Haplotype-resolved raw unitig【2】 graph in GFA【3】 format）：该结果文件保留组装生成的所有单倍型信息包括体细胞突变，测序错误。
prefix.p_utg.gfa （Haplotype-resolved processed unitig graph without small bubbles ）：对上面raw unitig 进行过滤，去掉由于体细胞突变和数据背景噪音引起的small bubbles（这个并不是真正的单体型信息），对于高度杂合基因组物种优先选择这个结果。
prefix.p_ctg.gfa （Primary assembly contig【4】 graph）：this is the preferred output for inbred strains or human，对于低杂合度物种来说，优先选择该文件；对于高杂合度物种，该结果代表其中一个单倍型。
prefix.a_ctg.gfa （Alternate assembly contig graph）：组装出来的另一套单体型基因组结果。
prefix.ec.fa ：Haplotype-aware error corrected reads in fasta format
prefix.ovlp.paf ：All-to-all overlaps in the PAF【5】 format
07
结果测评
将hifiasm 组装 gfa 结果 转成 fasta
perl hifi2fa.pl ctg/utg.gfa outfile
hifiasm 组装结果 fa N50评估
组装结果大小3.2G，和已知人基因组结果一致 N50：19M。
注意事项
投递内存设置 ：数据量100G 时建议投递1.5倍大小 100 *1.5= 150G内存。如果遇到内存报错，可按照3倍数据量大小内存设置进行投递。
hifiasm 组装：通过比较发现，减小bubbles 的大小，会明显提升组装的速度，组装结果N50会降低。从准确度考虑，建议使用默认参数，增加线程数目。
END
reference
https://github.com/chhylp123/hifiasm
unitig（http://wgs-assembler.sourceforge.net/wiki/index.php/Celera_Assembler_Terminology）
GFA（https://github.com/pmelsted/GFA-spec/blob/master/GFA-spec.md）
contig（http://wgs-assembler.sourceforge.net/wiki/index.php/Celera_Assembler_Terminology）
PAF（https://github.com/lh3/miniasm/blob/master/PAF.md）
作者：童蒙
编辑：amethyst